配景：帕金森病（PD）中左旋多巴诱发的异动症（LID）的病理生理学机制尚不解确。盛大研究的实验数据支撑这么一种不雅点，即纹状体成功通路中 D1 多巴胺受体阳性中等多棘神经元的畸形行径与 LID 议论。然而裸舞 抖音，这些纹状体神经元的及时行径与异动症症状之间的成功议论仍有待详情。

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方法：咱们通过在慢性左旋多巴给药开拓出畅通抵制症状的 D1-Cre 型帕金森病大鼠模子中，研究了急性左旋多巴调理对左旋多巴开拓的畅通抵制（LID）中纹状体 c-Fos 抒发的影响。咱们利用基于 GCaMP6 的在体光纤光度测定法研究了畅通抵制行动期间纹状体 D1+神经元的及时动态变化。咱们还通过光遗传学和化学遗传学方法研究了纹状体 D1+神经元失活对 LID 大鼠畅通抵制的影响。

收场：在左旋多巴打针后，LID 大鼠纹状体 D1+神经元中 c-Fos（一种世俗用于象征神经元激活的记号物）的抒发增多。光纤光度测定透露，在左旋多巴给药后 LID 大鼠出现异动症行动期间，纹状体 D1+神经元同步过度活跃。与这些不雅察收场一致的是，纹状体 D1+神经元的光遗传学失活足以遏制 LID 动物的大部分异动症行动。此外，纹状体 D1+神经元的化学遗传学遏制蔓延了左旋多巴给药后异动症行动的出现。

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论断：咱们的数据标明，纹状体 D1+神经元群体的畸形行径与 LID 大鼠及时出现的畅通抵制症状存在因果关联。

一、先容

帕金森病（PD）是一种进行性神经退行性疾病，会导致进行性畅通功能抵制。帕金森病的主要病理特征是黑质考究部（SNc）多巴胺能神经元的进行性圆寂。左旋多巴，即多巴胺的前体分子，是帕金森病症状调理的主要药物。不幸的是，左旋多巴在帕金森病中的积极效用常常会导致不良畅通波动的出现。左旋多巴开拓的异动症（LID）是遥远使用左旋多巴后最严重的畅通波动。对 LID 病理生理学有更久了的了解，关于更动其防患和调理门径具有挫折价值。

纹状体是规定自主畅通的主要皮质下结构之一。纹状体中的神经元行径受来繁荣脑皮层的谷氨酸能纤维和来自黑质考究部的多巴胺能投射的影响。纹状体中的中等多棘投射神经元（MSNs）可把柄多巴胺受体的类型分为两类。大要一半的这些神经元抒发多巴胺 D1 受体，并单突触投射至基底神经节输出核，造成成功通路。其余一半的神经元为抒发 D2 受体的神经元，它们造成多突触的波折通路。成功通路中 D1+神经元的激活被觉得有助于畅通，其功能受多种病理和药理身分的影响。先前的研究标明，帕金森病（PD）和左旋多巴开拓的异动症（LID）与纹状体成功和波折通路的畸形行径议论。研究标明，多半实验数据支撑这么一种不雅点，即纹状体 D1 多巴胺受体信号传导增强在左旋多巴开拓的异动症（LID）的分子病理学中起着要道作用。帕金森病（PD）中的多巴胺耗竭会裁汰 D1+纹状体中等多棘神经元（MSNs）的放电频率。相背，左旋多巴会训诫 D1+纹状体中等多棘神经元的放电频率，而况在帕金森病小鼠模子中，这些神经元的光遗传学激活可诱发访佛异动症的症状。然而，纹状体 D1+中等多棘神经元的行径与 LID 动物特定异动症症状之间的及时关系仍不明晰。

为治理这一问题，咱们接管基于 GCaMP 的光纤光度法，对解放行径的左旋多巴开拓异动症（LID）大鼠在予以左旋多巴后纹状体 D1+神经元群体的及时行径进行了光学纪录。随后，咱们利用光遗传学和化学遗传学方法千里默这些神经元，以评估纹状体 D1+神经元失活对 LID 大鼠左旋多巴开拓异动症状的影响。咱们发现纹状体 D1+神经元群体的行径与异动症状存在因果关系。咱们的研究收场标明，LID 存在与行动议论的细胞类型特异性神经元机制。

二、材料与方法

01.动物

本研究使用了佩戴 Drd1-Cre 转基因的杂合子大鼠（斯普拉格 - 谈利遗传配景）。为确保大鼠具有强健的遗传配景，咱们将 Drd1-Cre 大鼠与野生型大鼠杂交至少六代。通过团员酶链式响应检测尾部基因组 DNA 来刚毅转基因 Drd1-Cre 大鼠后代的基因型。采纳 8 - 10 周龄、体重 230 - 250 克的雄性大鼠进行实验。大鼠群养在 12 小时光照/迷蒙周期的环境中，解放获吊水和啮齿动物饲料。系数实验有谋划均慑服 ARRIVE 指南，并严格依照好意思国国立卫生研究院《实验动物照顾和使用指南》推论，且已获取西安交通大学动物实验伦理委员会的批准。咱们尽一切戮力减少实验动物的数目并放松其灾荒。

02.立体定向动物手术和左旋多巴给药

大鼠的处理神色如图 1A、B 所示。系数手术均在立体定向框架下使用无菌时刻进行。大鼠用 5%异氟烷麻醉，并以 1 - 2%异氟烷看护麻醉。如先前所述，向大鼠左侧内侧前脑束单侧打针 6 - 羟基多巴胺盐酸盐（6 - OHDA；融化在含 0.02%抗坏血酸的冰冷生理盐水，12 μg/4 μl）（坐标：联系于前囟和硬脑膜名义，前后 - 4.20 毫米；外侧 - 1.25 毫米；背侧 - 7.80 毫米）。多巴胺能毁伤的效用在术后 2 周通过阿扑吗啡开拓（0.05 毫克/千克，皮下打针）对侧旋转实际进行考证。

图 1. 在左旋多巴开拓的畅通抵制（LID）大鼠模子中，纹状体 D1 受体阳性神经元被激活。（A）研究的实验联想。（B）通过在左侧内侧前脑束（Mfb）进行立体定向打针 6-羟基多巴胺（6-OHDA）开拓多巴胺能毁伤。打针侧（左侧；比例尺 = 500 μm）和对侧完好意思侧的黑质考究部（SNc，C）和纹状体（Str，D）的酪氨酸羟化酶（TH）染色的显微相片。浅近线性追想分析讲解了总纹状体多巴胺能去神经主管的百分比与总畸形不自主畅通量表（AIMs）得分（E；n = 16）或纹状体 c-Fos + 神经元计数/平方毫米（F；n = 16）之间的议论性。线性追想分析讲解了纹状体 c-Fos + 神经元计数/平方毫米与 AIMs 得分之间的议论性（G；n = 16）。左旋多巴给药后 D1-Cre-mCherry LID 大鼠纹状体脑切片中 c-Fos 免疫响应性的定量（H；红色：D1-Cre-mCherry 阳性的 c-Fos + 神经元的百分比，绿色：c-Fos 阳性的 D1-Cre-mCherry + 神经元的百分比）和代表性组织学（I，比例尺 = 50 μm）。APO，阿扑吗啡；Cre，环化重组酶；AAV，腺议论病毒；AIMs，畸形不自主畅通量表；VTA，腹侧被盖区。

在阿扑吗啡测试后 1 至 2 周，在 6-OHDA 毁伤同侧的背侧纹状体（前后，+0.6 毫米；外侧，-3.6 毫米；背侧，-3.6 毫米）内注入了载体病毒。AAV5-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-pA、AAV5-EF1a-DIO-eNpHR3.0-EYFP-WPRE-pA、AAV5-EF1a-DIO-GCaMP6m-WPRE-hGH-pA、AAV5-hSyn-DIO-mcherry 和 AAV5-hSyn-DIO-hM4Di-mCherry 被制备并包装成病毒载体。打针量为 300 纳升。关于光遗传学和光纤光度测定测试，在病毒注入后立即在打针坐标上方 0.3 至 0.5 毫米处植入光学插芯光纤（外径：220 微米，NA：0.37）（图 2A、3A）。植入后，使用牙科水泥将光纤固定在颅骨上。手术后至少 4 周，待动物还原且病毒抒发后才进行行动测试。病毒打针一周后，予以左旋多巴加苄丝肼（L-3，4-二羟基苯丙氨酸甲酯盐酸盐，6 毫克/千克；盐酸苄丝肼，12 毫克/千克，皮下打针）每天打针一次，握续 21 天。慢性左旋多巴调理 3 周后，每只大鼠每隔 20 分钟不雅察 180 分钟，并使用畸形不自主畅通量表（AIMs）的圭臬要领对包括轴性、肢体、黑白和对侧圆周畅通在内的四种畅通抵制亚型进行评分，评分限制为 0 至 4 分（图 3B）。每个期间点的 AIMs 最高评分为 16 分。出现显然畅通抵制症状且 AIMs 评分高的大鼠被归入 LID 组，而莫得显然畸形不自主畅通的大鼠被归入非畅通抵制（非 LID）组。

图 2. 左旋多巴开拓的畅通抵制（LID）大鼠在畅通抵制期的纹状体 D1+神经元群体行径。（A）基于 GCaMP6m 的光纤光度测定法的实验配置（比例尺 = 200 μm）。在左旋多巴打针后 30 - 80 分钟获取的日常对照（B）、非 LID 大鼠（C）和 LID 大鼠（D）的代表性纹状体 D1 + GCaMP 信号（dF/F，300 秒）。（E）LID 大鼠的等领受规定（410 nm，紫色）和 GCaMP（蓝色）的光度测定轨迹，透露 GCaMP 荧光（dF/F）权臣增多，这与每次畅通抵制发作（玄色垂直线）议论。（F）从日常、非 LID 和 LID 大鼠获取的 GCaMP 荧光轨迹（300 秒，dF/F）的功率谱密度（PSD）图（数据透露为平均值±平均值的圭臬漏洞，每组 n = 8）。（G）从日常、非 LID 和 LID 大鼠的 GCaMP 荧光轨迹（dF/F）获取的功率（0.2 - 7 Hz，额外 5 分钟）（每组 n = 8，接管过后 Student-Newman-Keuls 方法的 Kruskal-Wallis 单向秩方差分析：H2 = 12.560，P = 0.002；LID 与非 LID：q = 5.000；LID 与日常：q = 4.159；日常与非 LID：q = 3.267；*P < 0.05裸舞 抖音，**P < 0.01）。与每次畅通抵制发作初始对皆的 GCaMP（顶部）或等领受规定（底部）轨迹的代表性热图（H）和事件周围期间直方图（PETH，I）。SC，皮下。

图 3. 纹状体 D1+神经元的光遗传学遏制遏制了左旋多巴开拓的畅通抵制（LID）大鼠的畸形不自主畅通。（A）使用立体定向打针 Cre 依赖性 AAV 在纹状体 D1+神经元中抒发 eNpHR3.0 或 eYFP 的光遗传学测定实验联想（比例尺 = 200 μm）。（B）受畅通、轴向、前肢和黑白畸形不自主畅通影响的 LID 大鼠的相片。（C）eNpHR3.0 或 eYFP 大鼠纹状体黄光（592 nm）映照前、映照期间和映照后的总畸形不自主畅通量表（AIMs）得分变化[eNpHR 组 n = 11，eYFP 对照组 n = 9；接管过后 Holm-Sidak 法的双向重迭测量方差分析（ANOVA）：F(1， 18) = 5.910，P = 0.026；*P < 0.05，**P < 0.01]。纹状体黄光对畅通（D）、轴向（E）、前肢（F）和黑白（G）AIMs 得分的影响（接管过后 Holm-Sidak 法的双向重迭测量方差分析；（D）F(1， 18) = 10.389，P = 0.005；（E）F(1， 18) = 9.821，P = 0.006；（F）F(1， 18) = 3.649，P = 0.072；（G）F(1， 18) = 1.219，P = 0.284；*P < 0.05，**P < 0.01。

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关于单突触狂犬病病毒跟踪，情色图片将 AAV2-EF1a-DIO-oRVG-WPRE-hGH-pA 和 AAV2-EF1a-DIO-H2B-eGFP-T2A-TVA-WPRE-hGH-pA（BrainVTA）以 1:3 的比例羼杂，然后打针到纹状体中。大要 3 周后，在归拢位置打针 EnvA G 缺失的狂犬病-dsRed（BrainVTA）（图 4A）。

图 4. 纹状体 D1-Cre+神经元接收来自多个脑区的单突触输入，并成功向基底神经节的主要输出核发送纤维。（A）讲解用于单突触逆行狂犬病病毒跟踪的病毒打针要领的默示图（左）。抒发 eGFP 和 dsRed 算作逆行跟踪肇始细胞的纹状体 D1-Cre+神经元（右）。（B）向纹状体 D1-Cre+神经元发送单突触神经主管的主要脑区，包括皮质（左）、丘脑（中）和黑质考究部（右）。TH：酪氨酸羟化酶，比例尺 = 200 微米。（C）来自纹状体 D1+神经元的荧光神经末梢。通过在 D1-Cre 大鼠的纹状体中打针 AAV5-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-pA 象征纹状体 D1+神经元。Str，纹状体，GPi，内惨白球，GPe，外惨白球，Ic，内囊，Cp，大脑脚，SNr，黑质网状部（比例尺 = 1000 微米）。

03.基于 GCaMP6 的钙纤维光度测定法

接管双色多通谈纤维光度测定系统检测并纪录 GCaMP6m 的荧光信号。纪录口头如图 2A 所示。一根光纤与用于纤维光度测定的光纤旋转接头（FRJ_1×1_PT，Doric Lenses）集成，用于指示纤维光度测定系统与植入的光学插芯光纤之间的光。来自觉光二极管的 470 纳米和 410 纳米波长的光历程带通滤波后分辩算作钙离子依赖性和钙离子非依赖性对照测量的引发光源送入大脑。为减少光漂白，光纤顶端的光强度配置为 20 微瓦。接管时期复用时刻同期获取钙离子依赖性的 GCaMP 信号和钙离子非依赖性的对照信号。通过归拢根光纤传输的辐射光历程带通滤波（通带：535 ± 25 纳米），并由科学级互补金属氧化物半导体相机以每秒 40 帧的采样频率进行蚁集（图 2A）。来自流线型光纤光度计的数据和来自高速数码摄像机的及时大鼠行动视频与数据蚁集系统同步。通过视频评分详情每次畅通抵制事件的肇始期间。光纤光度计的原始数据和及时行动视频分辩保存为 CSV 和 MP4 文献。

分析使用定制的 MATLAB 剧本和光度学模块分析器具（pMAT）进行。咱们从 470 纳米信号中减去按比例缩放的 410 纳米参考轨迹，以获取畅通变嫌后的 470 纳米信号。咱们通过从每个期间点的信号中减去中位信号，然后将该值除以中位信号来筹商畅通变嫌后的 470 纳米信号的归一化变化（dF/F）。在 pMAT 套件入网算事件周围期间热图和直方图时，事件窗口配置在 LID 大鼠每个异动事件的肇始期间周围。基线窗口界说为每个事件窗口之前的 0.5 秒（图 2F、G）。然后使用 Welch 方法 [MATLAB 中的 pwelch() 函数] 计算 GCaMP 信号（dF/F，300 秒）的相应功率谱密度（PSD），窗口大小为 10 fs（信号的采样率）。通过积分 PSD 计算值 [MATLAB 中的 bandpower() 函数] 筹商主频带（0.2 - 7 Hz）内的平均带功率。

02.体内光遗传学和化学遗传学

使用黄色激光（Aurora120-589，589 纳米，50 毫瓦）进行光遗传学遏制的光传递。使用刺引发生器规定激光光的频率和脉冲宽度。光通过一根直径为 200 微米、数值孔径为 0.37 的光纤传递到大脑，该光纤通过一个锆套与植入的插芯光纤邻接。如先前所述，对光纤顶端下方 0.5 毫米处脑区的光功率进行了校准。在光失活实验中使用的校准光功率密度（光纤顶端下方 0.5 毫米处）为 5 毫瓦/平方毫米。在予以左旋多巴 50 - 70 分钟后，将 LID 大鼠单独置于箱体中心，对其异动行动进行 9 分钟的跟踪，在初始后 3 分钟施加 3 分钟的光遏制（589 纳米，10.5 秒开/2 秒关脉冲，0.08 赫兹）（图 3A）。系数行动均被摄像并离线分析。

氯氮平-N-氧化物（CNO，BML-NS105-0005）崭新融化于生理盐水（0.9%氯化钠；1 毫克/毫升）中。以 5 毫克/千克的剂量腹腔打针 CNO 以千里默 hM4Di。行动测试常常在打针 CNO 后 30 - 40 分钟以及左旋多巴给药后立即进行。生理盐水算作溶剂对照。在化学遗传学测试中，跟踪 180 分钟的畅通抵制行动（图 5A）。

图 5. 纹状体 D1+神经元的化学遗传千里默遏制了左旋多巴开拓的畅通抵制（LID）大鼠的畸形畅通。（A）使用立体定向打针 Cre 依赖性 AAV 在纹状体 D1+神经元中抒发 hM4Di-mCherry 或 mCherry 的化学遗传测定实验联想。（B）纹状体内输注 AAV-DIO-hM4Di-mCherry 后 D1-Cre 大鼠纹状体脑切片的代表性显微相片。（C）在不同组的畅通抵制大鼠中，左旋多巴给药和腹腔打针氯氮平-N-氧化物（CNO）或生理盐水（Sal）后，每隔 20 分钟每个期间点的畸形不自主畅通量表（AIMs）得分的期间进度图（hM4Di+Sal 组 n = 8，hM4Di+CNO 组和 mCherry+CNO 组 n = 7；双向重迭测量方差分析（ANOVA），过后 Holm-Sidak 法：F(2， 219) = 8.641，P = 0.002；hM4Di+CNO 与 hM4Di+Sal 比较：*P < 0.01；hM4Di+CNO 与 mCherry+CNO 比较：#P < 0.01）。hM4Di+Sal（n = 8）、hM4Di+CNO（n = 7）和 mCherry+CNO（n = 7）组之间畅通抵制行动的不同参数比较（D - G；光棍分方差分析，过后 Holm-Sidak 法：F(2， 21) = 11.361，P < 0.001（D）；F(2， 21) = 9.402，P = 0.001（E）；F(2， 21) = 1.457，P = 0.258（F）；F(2， 21) = 8.744，P = 0.002（G）；*P < 0.01，**P < 0.001，NS，无权臣各别；IP，腹腔内。

03.组织学与免疫组织化学

在临了一次予以左旋多巴后 80 - 100 分钟，大鼠被予以过量的 20% 尿烷，然后悉腹黑灌输 200 毫升 0.01 摩尔/升磷酸盐缓冲盐水（PBS），接着灌输 300 毫升 4% 多聚甲醛。取出大脑，置于 4% 多聚甲醛中 8 小时，然后浸泡在 30% 蔗糖溶液中，直至下千里。使用冷冻切片机沿冠状面切片，切片厚度为 30 微米。将切片贴在载玻片上，用于详情光纤和病毒抒发的剖解位置。为详情打针 6 - 羟基多巴胺后多巴胺能神经元退化的程度，对黑质考究部（SNc）和纹状体进行了酪氨酸羟化酶（TH）免疫荧光组织化学检测（图 1C、D）。仅使用左 SNc 中 TH 免疫响应性实在系数丧失（> 97%）的大鼠来分析数据。此外，还使用免疫荧光组织化学不雅察纹状体中 c - Fos 或 D1 染色的定位。切片在含单克隆鼠抗 c - Fos 一抗（1：1200）或含多巴胺β羟化酶（TH）的兔多克隆抗体溶液（1：1200）中于 4°C 孵育 24 小时。历程屡次冲洗后，切片在室温下与驴抗小鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 488，1:500）或驴抗兔 IgG H&L（Alexa Fluor 594，1:1000）抗体共同孵育 2 小时。随后，切片在 PBS 中冲洗，用 Fluoromount-G 凝胶封片。使用荧结拜微镜（BX51）从切片中获取数字图像。使用 ImageJ 中的细胞计数插件对荧光图像进行共定位和定量分析。

04.定量分析与统计学分析

数据以平均值±平均值的圭臬漏洞或中位数透露（视情况而定）。接管光棍分方差分析（ANOVA）诱导过后 Holm-Sidak 历练或秩次的 Kruskal-Wallis 光棍分方差分析诱导过后 Student-Newman-Keuls 历练来比较三个或更多组的单个变量。关于具有两个以上期间点且不啻一个自变量的数据，接管双身分重迭测量方差分析诱导过后 Holm-Sidak 历练。统计学权臣性设定为 P < 0.05。数据使用分析软件进行处理。

三、收场

在单侧黑质纹状体束（MFB）经 6-羟基多巴胺（6-OHDA）毁伤并接受慢性左旋多巴（6 毫克/千克）调理后（图 1A），咱们评估了纹状体多巴胺能神经元缺失对左旋多巴皮下打针 80 - 100 分钟后异动症总评分和纹状体 c-Fos 抒发的影响。左旋多巴（图 1I）的给药，而非生理盐水（补充图 1），增多了左旋多巴开拓异动症（LID）大鼠纹状体的 c-Fos 抒发。左旋多巴打针后的 c-Fos 抒发局限于单侧纹状体区域，该区域存在系数的多巴胺能神经元缺失。然而，在同侧纹状体实在系数的酪氨酸羟化酶（TH）缺失（图 1D）后，纹状体系数多巴胺能神经元毁伤的面积百分比与异动症总评分和每平方毫米纹状体 c-Fos+神经元计数（图 1E、F）之间无权臣议论性。相背，每平方毫米纹状体 c-Fos+神经元计数与异动症总评分（图 1G）权臣议论。

为了探究纹状体 D1 受体阳性神经元在调节异动症中的作用，咱们在予以左旋多巴后监测了 D1+神经元中的 c-Fos 抒发。在纹状体内打针 AAV5-hSyn-DIO-mCherry 四周后，使用 D1-Cre 异动症大鼠进行实验。免疫染色透露，左旋多巴给药后，异动症大鼠纹状体神经元中 c-Fos 抒发权臣增多，且 D1-Cre-mCherry 象征了相等一部分由左旋多巴激活的 c-Fos+神经元（图 1I）。值得选藏的是，左旋多巴激活的 c-Fos+纹状体神经元中，大多数（66.97%）为 D1-Cre-mCherry 阳性，而 D1-Cre-mCherry+纹状体神经元中有 30.58% 抒发 c-Fos（图 1H）。

此外，咱们利用 Cre 依赖的单突触逆行狂犬病系统筛选出向纹状体 D1-Cre+神经元发送输入的脑区（图 4A）。皮质和丘脑的投射神经元以及黑质考究部的多巴胺能神经元被详情为纹状体 D1-Cre+神经元的单突触上游（图 4B）。顺行跟踪研究透露，纹状体 D1-Cre-eYFP+神经元的纤维成功投射到基底神经节的输出核团，即内惨白球和黑质网状部。相背，D1-Cre-eYFP+纤维在外部惨白球等分散荒芜（图 4C）。收场阐明纹状体 D1-Cre+神经元参与了基底神经节的成功通路。

01.在左旋多巴开拓的异动症大鼠异动行动期间纹状体 D1+神经元群体行径的研究

咱们研究了左旋多巴开拓的异动症（LID）大鼠在异动期纹状体 D1+神经元的响应。接管在体钙成像与光纤光度法纪录了 LID 大鼠和非 LID 大鼠在打针左旋多巴后以及日常 D1-Cre 大鼠（未作念 6-OHDA 毁伤且未予以左旋多巴）纹状体 D1+神经元群体行径。咱们通过病毒在 6-OHDA 毁伤侧纹状体的 D1+神经元中抒发遗传编码的钙指令剂 GCaMP6m。GCaMP6m 的抒发主要局限于背外侧纹状体（图 2A）。咱们纪录了日常对照组、非 LID 大鼠和 LID 大鼠在予以左旋多巴后的纹状体 D1+神经元 GCaMP 荧光信号（图 2B-D）。三组纹状体 D1+神经元群体行径的信号主要分散在低频段（0.2 - 7 赫兹；图 2F）。然而，三组纹状体 D1+神经元 GCaMP 荧光信号的幅度存在各别（图 2B-D）。

定量分析标明，左旋多巴开拓的异动症（LID）大鼠纹状体 D1+神经元 GCaMP 荧光信号的平均功率（0.2 - 7 赫兹）权臣高于非 LID 大鼠和日常对照组（图 2G）。这些发现标明，LID 大鼠纹状体 D1+神经元因左旋多巴给药而过度激活。然而，尚不明晰这些神经元是否会在每个异动期被激活。为了治理这个问题，咱们通过画图与每次异动畅通肇始期间对皆的 D1+神经元 GCaMP 荧光信号的热图和事件议论期间直方图（PETHs），来查验 LID 大鼠异动期的时序响应特征。把柄异动畅通的肇始期间对纹状体 D1+神经元群体行径进行排序，发现 LID 大鼠纹状体 D1+神经元群体行径在每次异动畅通时达到峰值（图 2E、H、I 和补充视频 1）。在异动行动期间，咱们未不雅察到与之议论的钙离子寥寂规定荧光信号的变化，这标明畅通引起的伪影对荧光信号的孝敬不错忽略不计（图 2H、I）。

02.光遗传学遏制纹状体 D1+ 神经元可放松左旋多巴开拓的异动症大鼠的异动行动

在左旋多巴开拓的异动症（LID）大鼠出现异动行动时，不雅察到纹状体 D1+ 神经元群过度活跃，但纹状体 D1+ 神经元在左旋多巴开拓的异动行动中的功能作用尚未系数发扬。为治理这一问题，咱们在 LID 大鼠的纹状体 D1+ 神经元中单侧病毒抒发快速光激活电生氯离子泵 eNpHR3.0（图 3A）。为了详情纹状体 D1+ 神经元失活对 LID 大鼠异动行动的影响，当动物出现强健且严重的异动症状时，咱们予以黄光映照（图 3A、B）。与 eYFP 对照组比较，光遗传学遏制纹状体 D1+ 神经元可裁汰 eNpHR3.0 抒发的 LID 大鼠的畅通、轴向、肢体和总异动症评分（图 3C-F 和补充视频 2）。然而，黄光映照对 eNpHR3.0 抒发的 LID 大鼠的黑白异动症评分莫得影响（图 3G）。这些收场标明，纹状体 D1+ 神经元的过度活跃是 LID 大鼠大多数异动症状所必需的。

03.化学遗传学遏制纹状体 D1+ 神经元可减速左旋多巴给药后异动症行动的发生

咱们测试了遥远遏制 LID 大鼠纹状体 D1+ 神经元群体行径是否会影响其在左旋多巴打针后的异动症行动。通过纹状体内微量打针 AAV5-Syn-DIO-hM4Di-mCherry-WPRE-pA，使纹状体 D1+ 神经元单侧抒发与 mCherry 交融的 Gi 耦合联想受体（DREADDi）（图 5A、B）。AAV5-Syn-DIO-mCherry-WPRE-pA 算作对照。DREADDi 与氯氮平 N-氧化物（CNO）特异性诱导后，可使抒发 hM4Di-mCherry 的神经元超极化。咱们通过轮流打针生理盐水和 CNO（5 毫克/千克体重），研究了纹状体 D1+ 神经元失活对 LID 大鼠异动症行动的影响。LID 大鼠在全身打针 CNO/生理盐水和左旋多巴后不雅察 180 分钟，并对异动症行动进行评分（图 5A、C）。双向重迭测量方差分析透露，三组间存在权臣的总体各别 \[ F(2， 219) = 8.641，P = 0.002 \]，期间点间也存在权臣各别 \[ F(9， 219) = 381.419，P < 0.001 \]，而况这些参数间存在权臣交互作用 \[ F(18， 219) = 2.767，P < 0.001 \]。过后比较（Holm-Sidak 法）标明，hM4Di+CNO 组的 AIMs 评分权臣低于 hM4Di+Sal 组和 mCherry+CNO 组（分辩为 P = 0.002 和 P = 0.003；图 5C）。此外，咱们发现 CNO 打针在早期阶段权臣减少了 hM4Di 抒发的 LID 大鼠的畅通抵制行动。与 hM4Di+Sal 组和 mCherry+CNO 组比较，CNO 打针权臣延长了 hM4Di+CNO LID 大鼠在左旋多巴打针后畅通抵制施展的逃避期（图 5C、D）。CNO 介导的失活权臣减少了 hM4Di 抒发的 LID 大鼠畅通抵制的握续期间和总 AIMs 评分，但不影响最高 AIMs 评分（图 5E-G）。

四、盘问

在本研究中，咱们应用剖解学和功能学的方法来探究大鼠左旋多巴开拓的异动症（LID）的纹状体神经元议论性。通过一系列实验，咱们详情纹状体 D1+ 神经元群体的畸形动态可能是 LID 的潜在神经机制。

东谈主们广泛觉得纹状体的畸形激活与左旋多巴开拓的异动症（LID）的病理生理学议论。左旋多巴的给药会开拓 LID 大鼠纹状体中好多神经元抒发 c-Fos 和 ΔFosB 卵白，这两种卵白是神经元激活的倡导。与之前的论说一致，咱们的收场标明纹状体中 c-Fos+神经元的数目与总异动症评分密切议论。激活的 c-Fos+神经元的细胞类型尚未系数明确。多样不雅察标明，c-Fos 和 ΔFosB 卵白是由纹状体 D1 多巴胺受体/卵白激酶 A/DARPP-32/ERK 信号通路增强产生的。把柄这些论说，咱们不雅察到在 LID 大鼠中，纹状体 D1-Cre-mCherry+神经元在左旋多巴打针后优先抒发 c-Fos。这一发现关于寻找介导 LID 的特定纹状体神经元类型相等挫折。与这些收场一致，来自 LID 小鼠的电生理数据标明，左旋多巴增多了纹状体 D1+神经元的放电频率。应当指出的是，在予以左旋多巴后，少数 c-Fos+ 纹状体神经元在左旋多巴开拓的异动症（LID）大鼠中对 D1-Cre-MCherry 呈阴性（图 1E）。如补充图 2 所示，AAV5-hSyn-DIO-mCherry 并非在系数 D1+ 神经元中都收效抒发。因此，在检测中，一些 c-Fos+ 和 D1 阳性神经元未透露出 mCherry 抒发。此外，已有报谈指出，在 LID 动物的背外侧纹状体中，少数 D1 阴性的中等多棘神经元和中间神经元中出现了 ΔFosB 积存。这标明在左旋多巴调理后，也有相等数目的 D1 阴性神经元被激活。此外，值得选藏的是，在本研究中，左旋多巴打针后 D1-Dre-mCherry+ 神经元中 c-Fos 阳性神经元的比例并不高。咱们将这一收场归因于本研究中左旋多巴的剂量。与之前的研究不同，咱们在实验中使用了较低剂量的左旋多巴（6 毫克/千克，皮下打针），以减少左旋多巴在大鼠中的反作用。

上述系数发现均标明，在左旋多巴开拓的异动症（LID）期间，纹状体 D1+ 神经元被激活，但这些发现并不可解释这些神经元是否成功介导异动症。在 LID 小鼠的异动症阶段，纹状体 D1+ 神经元的单个神经元行径增多。然而，这些数据并未标明纹状体 D1+ 神经元的单个神经元行径与每一种异动症畅通之间存在成功议论。已有报谈标明，基于畅通皮质神经元的群体行径不错商量身体畅通。因此，咱们假定纹状体 D1+ 神经元群体能源学的畸形可能介导 LID 中的异动症行动。光纤光度测定法八成量化神经元群体行径与及时行动之间的关系。在本研究中，咱们使用基于 GCaMP6 的光纤光度测定法来探究纹状体 D1+ 神经元群体能源学在 LID 大鼠异动症行动中的及时作用。收场标明，LID 大鼠纹状体 D1+神经元 GCaMP 荧光信号的平均功率权臣高于对照组。此外，咱们不雅察到 LID 大鼠每次出现异动症畅通时，纹状体 D1+神经元的群体行径均达到峰值，这标明纹状体 D1+神经元的畸形群体行径与 LID 大鼠的异动症畅通同步。然而，要详情纹状体 D1+神经元行径与左旋多巴议论异动症之间的因果关系，咱们必须八成阁下 LID 大鼠纹状体 D1+神经元的行径，并不雅察阁下后的行动变化。

咱们利用 D1-Cre LID 大鼠中纹状体 D1+神经元的光遗传学遏制，测试了纹状体 D1+神经元的失活是否能成功影响左旋多巴开拓的畅通抵制行动。在打针了 eNpHR3.0 的 D1-Cre LID 大鼠中，黄光灵验遏制了左旋多巴给药后出现的大部分畅通抵制症状，包括畅通、轴性和肢体畅通抵制。这些发现与之前的一项论说一致，该论说标明在帕金森病小鼠模子中，纹状体 D1 抒发的中等多棘神经元的光刺激可开拓访佛畅通抵制的行动。这些收场标明，纹状体 D1+神经元群体的畸形过度活跃编码了畅通抵制信息，而况是畅通抵制症状抒发所必需的。LID 中纹状体 D1+神经元这种畸形行径的发病机制尚不明晰，可能是多方面的。纹状体镶嵌了一个复杂的输入汇集，包括来自黑质考究部的多巴胺能输入以及来自皮质和丘脑的谷氨酸能传入（图 4B）。左旋多巴引起的畸形不自主畅通可能标明在突触前和突触后水平都出现了适应不良的神经元可塑性效应。

基于 eNpHR3.0 的光遗传学遏制时刻拓展了对多种神经元细胞类型功能的因果关系聚会。然而，eNpHR3.0 的一个主要劣势在于其万古间（>15 秒）权臣的失活作用，这使其不恰当需要万古间遏制的应用。在咱们的实验中，即使接管间歇性黄光映照，基于 eNpHR3.0 的光遗传学遏制也无法万古间（>3 分钟）影响畅通抵制症状。为了进一步探索，需要优化光遗传学失活和光刺激的器具箱。为了在更万古间内阁下纹状体 D1+神经元的行径，本研究引入了化学遗传学器具。与通过蛮横的短期超极化来遏制神经元的 eNpHR 不同，hM4Di-DREADDi 八成在更万古间内截止超极化神经元。咱们不雅察到，通过打针氯氮平苯甲酰胺（CNO）对纹状体 D1+ 神经元进行化学遗传学千里默，可权臣且细小地减少抒发 hM4Di 的左旋多巴开拓的异动症（LID）大鼠在遥远服用左旋多巴后的异动行动。这些收场进一步阐明了纹状体 D1+ 神经元群体行径畸形与 LID 的议论性。

五、论断

咱们的数据标明，纹状体 D1+神经元群体的畸形行径与 LID 大鼠的及时畅通抵制症状存在因果关系，这标明这些神经元可能是 LID 调理的理念念靶点。

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